วัดมหาธาตุ ถือเป็นวัดคู่บ้านคู่เมืองยโสธรมาตั้งแต่แรกสร้างเมือง ตั้งอยู่ภายในเขตเทศบาลเมืองยโสธร ซึ่งภายในวัดมีโบราณสถานและโบราณวัตถุที่สำคัญคือ พระพุทธปฏิมาบุษยรัตน์ หรือพระแก้วหยดน้ำค้าง พระพุทธปรูปบูชาประจำเมืองที่มีขนาดเล็กที่สุดในประเทศไทย , พระธาตุอานนท์ พระเจดีย์ที่บรรจุอัฐิธาตุของพระอานนท์แห่งเดียวในประเทศไทย และหอไตรกลางน้ำที่มีศิลปะงดงาม มีพระเทพวงศาจารย์ (สำลี คุตตสีโล) เป็นเจ้าอาวาสวัดรูปปัจจุบัน

• พระพุทธปฏิมาบุษยรัตน์

หรือ พระแก้วหยดน้ำค้าง เป็นพระพุทธรูปปางสมาธิศิลปะสมัยเชียงแสน ในอดีตนั้นเคยประดิษฐานอยู่คู่กับพระแก้วมรกตในหอพระแก้วเมืองเชียงใหม่เป็นครั้งแรก ในปี พ.ศ. 2011 และประทับอยู่เป็นสิริมงคลนานถึง 78 ปี หลังพระเจ้าไชยเชษฐาธิราชเสด็จมาครองนครหลวงพระบาง จึงมีความเห็นว่าสมควรอัญเชิญพระแก้วมรกตและพระแก้วขาวไปไว้ที่ราชธานีล้านช้าง เพื่อให้ห่างไกลจากเงื้อมมือพม่าข้าศึก จึงทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้ประดิษฐานพระแก้วมรกตประทับอยู่ร่วมกันอีกครั้ง ต่อมาได้มีผู้ลักพาพระแก้วขาวออกจากนครหลวงพระบางไปซ่อนไว้ที่เขาส้มป่อย และมีนายพราน 2 พี่น้อง ชื่อ พรานทึงและพรานเทือง ไปพบว่าจมอยู่ใต้สระน้ำจึงนำขึ้นมา ความเลื่องลือไปถึงเจ้าสร้อยศรีสมุทรพุทธางกูร เจ้าผู้ครองนครจำปาศักดิ์ จึงให้ท้าวเพียผู้ใหญ่ไปสืบเอาพระแก้วขาวมา ขณะอัญเชิญมาถึงตำบลแห่งหนึ่งริมฝั่งแม่น้ำเซโดนได้พากันพักแรมหนึ่งคืน พอรุ่งเช้าปรากฏว่าพระแก้วขาวหายไปจึง ให้คนเที่ยวค้นหา มีผู้ไปพบอยู่ที่บ้าน พรานทึงดังเดิม ท้าวเพียได้ทำพิธีขอขมาคารวะพระแก้วขาว โดยขออัญเชิญไปยังนครจำปาศักดิ์ได้สะดวกอย่าได้ลักหนีไปอีกเลย แต่ในระหว่างทางเกิดพายุทำให้พระแก้วขาวตกลงไปในน้ำหาอย่างไรก็ไม่พบ เจ้าสร้อยศรีสมุทรพุทธางกูร ทรงกระทำพิธีกรรมบวงสรวงเทพารักษ์ ตั้งสัตยาธิษฐานขอให้ได้พระแก้วขาวกลับคืนมาเป็นสิริมงคล เมื่อสัมฤทธิผลจึงจัดงานฉลองสมโภชเป็นเวลา 3 วัน 3 คืน ต่อมาเมื่อพระวิไชยราชสุริยวงษขัติยราช (ท้าวฝ่ายหน้า) พระประเทศราชผู้ครองนครจำปาศักดิ์ ลำดับที่ 3 ได้ถึงแก่พิราลัย เมื่อวันอังคาร ขึ้น 2 ค่ำ เดือน 10 ปีมะแมตรีศก จุลศักราช 1173 (พ.ศ. 2354) ครองเมืองนครจำปาศักดิ์ได้ 21 ปี พระบาทสมเด็จพระพุทธเลิศหล้านภาลัยจึงทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ ให้พระยากลาโหมราชเสนา เป็นข้าหลวงแทนพระองค์ ไปพระราชทานเพลิงศพพระวิไชยราชสุริยวงษขัติยราช และจัดการราชการบ้านเมืองนครจำปาศักดิ์ เมื่อทำการปลงศพของพระวิไชยราชสุริยวงษขัติยราชเสร็จแล้ว พระยากลาโหมราชเสนาพร้อมด้วยแสนท้าวพระยาในเมือง จึงก่อเจดีย์บรรจุอัฐิของท่านไว้ที่วัดเหนือ (ปัจจุบันคือวัดหอพระแก้ว) ในเมืองเก่าคันเกิง เรียกกันทั่วไปว่าในเวลานั้น "ธาตุหลวงเฒ่า" [4] ปัจจุบันไม่มีใครรู้จักและเรียก ภายหลังเสร็จการพระราชทานเพลิงศพของพระวิไชยวรราชสุริยวงศ์ขัตติยราช (ท้าวฝ่ายหน้า) และการจัดการราชการบ้านเมืองในนครจำปาศักดิ์แล้ว พระยากลาโหมราชเสนาจึงได้อัญเชิญพระแก้วขาวลงมายังกรุงเทพมหานคร เมือ่ปี พ.ศ. 2355 และเมื่อครั้งเจ้าพระยาราชสุภาวดี (สิงห์ สิงหเสนี) ได้ยกกองทัพไปตีนครเวียงจันทน์ ท้าวอุปราชฝ่ายบุต ซึ่งเป็นบุตรของพระวิไชยราชสุริยวงษขัติยราช (ท้าวฝ่ายหน้า)พระประเทศราชผู้ครองนครจำปาศักดิ์ องค์ที่ 3 พร้อมท้าวสุวอธรรมา (บุญมา) ได้ร่วมทำการรบด้วย โดยมีอัญญาพระครูหลักคำ (กุ) ผู้มีภูมิความรู้ถนัดในทางโหราศาสตร์ เป็นผู้ให้ฤกษ์และทำพิธีตัดไม้ข่มนาม ซึ่งเป็นพิธีปฐมกรรม อันเป็นการให้ขวัญและกำลังใจแก่ทหาร จึงทำให้การรบในครั้งนั้นประสบชัยชนะ ความทราบถึงพระบาทสมเด็จพระนั่งเกล้าเจ้าอยู่หัว รัชกาลที่ 3 จึงทรงมีรับสั่งให้เจ้าพระยาราชสุภาวดี นำอุปราชฝ่ายบุต และอัญญาพระครูหลักคำ (กุ) เข้าเฝ้าโดยด่วนที่กรุงเทพมหานคร ทรงพระกรุณาโปรดเกล้าฯ แต่งตั้งอุปราชฝ่ายบุตเป็นพระสุนทรราชวงศา มหาขัตติยชาติ ประเทศราชชวาเวียง ดำรงรักษ์ภักดียศฦๅไกร ศรีพิไชยสงคราม พระประเทศราชผู้ครองเมืองยศสุนทร ลำดับที่ 3 (พ.ศ. 2366-2400) พร้อมพระราชทานพระพุทธรูปบูชาสำคัญคือ พระพุทธปฏิมาบุษยรัตน์ หรือ พระแก้วหยดน้ำค้าง อันเป็นพระพุทธรูปคู่บ้านคู่เมืองยโสธรในปัจจุบัน , พระราชทานเชลยศึกจากนครเวียงจันทน์ จำนวน 500 ครอบครัว และพระราชทานปืนใหญ่ไว้สำหรับเมืองยศสุนทร 1 กระบอก อันมีชื่อว่า "ปืนนางป้อง" ซึ่งยังคงปรากฏอยู่ที่ศาลหลักเมืองยโสธรมาจนถึงปัจจุบัน

• พระธาตุอานนท์

หรือพระธาตุยโสธร ตั้งอยู่หน้าพระอุโบสถ เป็นพระธาตุเก่าแก่ที่สำคัญองค์หนึ่งในภาคอีสาน ร้างขึ้นเมื่อปี พ.ศ. 1218 ผู้ก่อสร้างคือ เจตตานุวิน และ จินดาชานุ ชาวเวียงจันทน์ กับ เอียงเวธา ชาวขอม เมื่อสร้างเสร็จจึงอัญเชิญพระอัฐิของ พระอานนท์ มาบรรจุไว้ ซึ่งพระอัฐิของพระอานนท์ที่นำมาบรรจุใน พระธาตุอานนท์ นั้น ถูกบรรจุไว้ในผอบ ชั้นนอกเป็นหีบเงิน 3 ชั้น ชั้นถัดไปเป็นหีบทอง 7 ชั้น ถัดจากนั้นเป็นหีบแก้วไพฑูรย์ 2 ชั้น (รวมเป็นหีบ 12 ชั้น) แล้วมีผ้ากะจ๋าคำ(ผ้าลายทอง) ห่อไว้อีก 500 ชั้น ถัดเข้าไปเป็นผ้าสีขาวอ่อนนุ่มเหมือนสำลีห่อพระอัฐิธาตุอยู่ โดยมีเรื่องเล่าเกี่ยวกับการสร้าง พระธาตุอานนท์ ต่อ ๆ กันมาว่า เจตตานุวิน และ จินดาชานุ ชาวเวียงจันทน์ ซึ่งเป็นลูกพี่ลูกน้องกัน หลังจากออกบวชทำความเพียรได้ 3 ปี 25 วัน ทั้งคู่ก็เห็นว่าชาวเมืองเวียงจันทน์ต่างนับถือ พากันไปกราบไหว้ ดอนปู่บาว จึงคิดนำของศักดิ์สิทธิ์มาไว้ที่ ดอนปู่บาว เพื่อความเป็นสิริมงคลยิ่ง ๆ ขึ้น ดังนั้น จึงออกธุดงค์โดยใช้เวลาประมาณ 2 ปี 10 เดือน 11 วัน เดินทางมาถึงเมืองเทวทหะ แคว้นโกลิยะ ปกครองโดย ท้าวพระยา ซึ่งขณะนั้นชาวเมืองกำลังก่อสร้างเจดีย์องค์หนึ่งอยู่ ครั้นก่อสร้างเสร็จ ท้าวพระยา จึงเข้าไปอัญเชิญพระอัฐิธาตุ ซึ่งต้องไขประตูเข้าไป 3 ชั้น จึงจะพบหีบพระอัฐิธาตุ เจตตานุวิน และ จินดาชานุ จึงสอบถามชาวเมืองได้จนได้ความว่าเป็นพระอัฐิธาตุของ พระอานนท์ พระเถระคนสำคัญของพระพุทธเจ้า ซึ่งเล่ากันว่า พระอานนท์ นิพพานบนอากาศกลางแม่น้ำโรหิณี (กั้นระหว่าง กรุงกบิลพัสดุ์ กับ กรุงเทวทหะ) พระองค์ได้อธิษฐานร่างกายให้แตกเป็น 2 ส่วน ส่วนที่หนึ่งตกลงทางกรุงกบิลพัสดุ์ ส่วนที่สองตกลงทางกรุงเทวทหะ เจตตานุวิน ได้ฟังดังนั้นจึงจัดเครื่องสักการะบูชา แล้วอธิษฐานจิตขอเห็นอภินิหาร ซึ่งก็บังเกิดมีลมพัดห่อผ้าอัฐิธาตุ (ห่อผ้ากะจ๋าคำ) ลอยขึ้นสู่อากาศเป็นอัศจรรย์ เจตตานุวิน จึงอธิษฐานจิตให้ห่อผ้าพระอัฐิธาตุลอยลงมา ห่อผ้าก็ลอยลงมาเป็นที่อัศจรรย์ยิ่งนัก ต่อมา เจตตานุวิน และ จินดาชานุ จึงอ้อนวอนขอแบ่งพระอัฐิธาตุจาก ท้าวพระยา อยู่หลายวัน จน ท้าวพระยา ใจอ่อนยอมแบ่งผงธุลีประมาณเต็ มเปลือกไข่นกกระเรียน กับอัฐิธาตุ 1 องค์ ประมาณเท่าดอกสังวาลย์ (คล้ายดอกลีลาวดี) ให้ เจตตานุวิน และ จินดาชานุ จึงเดินทางกลับเมืองเวียงจันทน์ และเตรียมจัดสร้างเจดีย์เพื่อบรรจุพระอัฐิธาตุที่ ดอนปู่ปาว แต่ชาวเมืองเวียงจันทน์ไม่ยินยอม ด้วยหาว่าผิดผีบ้านผีเมือง ทั้งยังขับไล่ออกจากเมือง เจตตานุวิน และ จินดาชานุ จึงหนีมาอยู่กับเจ้าเมืองขอม ชื่อว่า เอียงเวธา ครั้นผ่านไป 3 ปี จึงชักชวนให้ เอียงเวธา เป็นผู้นำสร้างเจดีย์ ซึ่ง เอียงเวธา ได้เลือกสถานที่สร้างเจดีย์ที่ ดงผีสิง (จังหวัดยโสธรในปัจจุบัน) ป่าทึบขนาดใหญ่ ไกลจากบ้านคนประมาณ 1.2 กิโลเมตร ใช้เวลาสร้างเจดีย์ 8 เดือน 25 วัน จึงแล้วเสร็จ สำหรับลักษณะของพระธาตุอานนท์ เจดีย์เป็นทรงสี่เหลี่ยมหรือทรงพรหมสี่หน้า ส่วนฐานเป็นรูปสี่เหลี่ยมจัตุรัส ยาวด้านละ 81 เมตร ก่ออิฐถือปูนเอวฐานคอดเป็นรูปบัวคว่ำบัวหงาย เหนือขึ้นไปเป็นเรือนธาตุ มีซุ้ม 4 ทิศ ประดิษฐานพระพุทธรูปประทับยืน ยอดธาตุมียอดปลีเล็กแซมทั้ง 4 ด้าน ยอดกลางทรงสี่เหลี่ยมสอบ มี 2 ชั้น รูปแบบการก่อสร้างคล้ายกับพระธาตุก่องข้าวน้อยฐาน ทุก ๆ ปีในช่วงเดือนมีนาคมทางวัดจะจัดให้มีงานสมโภชพระธาตุอานนท์ขึ้นเป็นประจำ โดยจัดในวันขึ้น 13 ค่ำ 14 ค่ำ และ 15 ค่ำ เดือน 3 ตามฮีตคลองของชาวอีสาน คือเดือนมีนาคม ในคืนแรกจะจัดพิธีสมโภชองค์ พระธาตุอานนท์ ผู้ที่มาร่วมงานแต่งกายด้วยชุดขาว ทำพิธีตลอดคืน ส่วนในคืนที่สองและคืนที่สามมีมหรสพรื่นเริงสมโภชตลอดคืน

• พระพุทธโลกนาถมหาธาตุยโสธร

พระพุทธโลกนาถมหาธาตุยโสธร พระพุทธรูปปางมารวิชัยเก่าแก่ที่สำคัญของวัด ประดิษฐานเป็นพระประธานแต่ครั้งพระอุโบสถยังเป็นสิมหลังเก่า ประทับนั่งขัดสมาธิราบบนฐานสูง มีฉัตรทอง 5 ชั้นห้อยลงมาจากเพดาน ฐานพระชั้นบนเป็นฐานกรีบบัว ประดับชายผ้าทิพย์ห้อยลงมาด้านหน้า สมเด็จพระสังฆราชเจ้า กรมหลวงวชิรญาณสังวร ได้ประทานนามพระพุทธรูปดังกล่าวว่า "พระพุทธโลกนาถมหาธาตุยโสธร" เมื่อ วันที่ 9 กันยายน 2556

• หอไตร

สร้างขึ้นเมื่อประมาณ พ.ศ. 2373 โดยพระครูหลักคำ (กุ) เจ้าอาวาสวัดมหาธาตุ รูปที่ 3 ตัวอาคารหอไตรสร้างด้วยไม้ตั้งอยู่กลางสระน้ำทางทิศตะวันออกเฉียงเหนือของพระธาตุอานนท์ เป็นที่เก็บคัมภีร์ใบลาน พร้อมพระไตรปิฏก และตำราต่างๆ ซึ่งพระครูหลักคำ (กุ) เป็นผู้นำมาจากนครเวียงจันทน์ แผนผังเป็นรูปสี่เหลี่ยมผืนผ้า ลักษณะแบบหอไตรภาคอีสานทั่วไป มีทางเดินโดยรอบติดกันใต้ชายคา บริเวณนี้เป็นที่เก็บรักษาตู้พระธรรม หีบพระธรรม เสลี่ยงชั้นวางคัมภีร์ซึ่งนำมาจากเวียงจันทน์ ซุ้มประตูและบานประตูไม้สลักลวดลายเครือเถาลงรักปิดทองอย่างสวยงาม การตกแต่งฝาผนังมีลวดลาย ซึ่งเป็นลักษณะผสมแบบภาคกลางสันนิษฐานว่า หอไตรน่าจะสร้างขึ้นประมาณสมัยรัชกาลที่ 4-5 แห่งกรุงรัตนโกสินทร์